di Giannetto Gianetti, Elena Ortalda, Silvio Grosso - Regione Piemonte, Settore Fitosanitario
Premessa
Nel 2011, su mele frigoconservate della cv. Ambrosia provenienti da due frutteti in comune di Centallo (CN), veniva riscontrata una inusuale manifestazione di marciume lenticellare asciutto. Gli esami effettuati nei laboratori del Settore Fitosanitario della Regione Piemonte (SFR) avevano portato all'isolamento di un fungo con caratteristiche chiaramente riferibili al genere Ramularia e non sovrapponibili a quelle di nessun’altra specie fungina di riconosciuta fitopatogenicità sul melo. Per identificare con sicurezza il micete, un isolato venne inviato al CBS - KNAW Fungal Biodiversity Centre di Utrecht (Olanda), che lo classificò come Ramularia eucalypti Crous, specie istituita solo pochi anni prima a seguito di un primo rinvenimento su foglie di eucalipto nel Lazio (Crous et al., 2007). Contestualmente, per accertare la fitopatogenicità degli isolati, venne effettuato, nei laboratori del SFR, un test mediante inoculazione su frutti di Ambrosia, che diede esito positivo. Vennero inoltre effettuate, nel corso dell'autunno, indagini per appurare l'eventuale presenza di infezioni in campo sui diversi organi del melo, a seguito delle quali vennero individuati attacchi a livello delle foglie, ma non degli organi legnosi e neppure dei frutti pendenti (Gianetti et al., 2012).
Negli anni successivi, oltre ai casi iniziali su Ambrosia, vennero riscontrate infezioni su partite di mele frigoconservate provenienti anche da altri comuni della provincia di Cuneo ed appartenenti sia alla cv. Ambrosia sia ad altre cultivar. Nel 2012 i tecnici del CReSO isolarono il fungo anche da frutti frigoconservati di pero cv. Conference con manifestazioni di tacche depresse (Giordani et al., 2012). Successivamente, anche su questo fruttifero si sono individuati sintomi fogliari. Nel 2013 poi i tecnici del SFR effettuarono due diversi tipi di test di laboratorio per saggiare l'efficacia in vitro di alcuni fungicidi nei confronti del patogeno (Ortalda et al., 2014).
Va infine rilevato che i ricercatori del CBS - KNAW Fungal Biodiversity Centre, a seguito di una recentissima revisione della specie complessa R. eucalypti, hanno riclassificato l'isolato piemontese come R. mali Videira & Crous, considerandolo specie nuova, della quale il ceppo citato costituisce ora l'olotipo (Videira et al., 2015).
Aggiornamento sulla distribuzione di R. mali
Al momento R. mali è stata isolata, in Piemonte, da mele frigoconservate di cultivar: Ambrosia, Golden Delicious, Red Delicious e Scarlet, provenienti dai seguenti comuni, tutti in provincia di Cuneo: Busca, Centallo, Costigliole, Cuneo, Dronero, Savigliano, Revello, Verzuolo, e da pere frigoconservate della cv. Conference provenienti dai comuni di Saluzzo, Savigliano e Scarnafigi, sempre in provincia di Cuneo.
Dopo i primi ritrovamenti in Piemonte, il micete è stato poi riscontrato anche in Trentino ed in Alto Adige (Lindner, 2013) su mele frigoconservate della cv. Golden Delicious, associato generalmente ad una sintomatologia alquanto superficiale, indicata come "chiazzatura lenticellare" ed analoga a quella osservabile in Piemonte sulla cv. Ambrosia nello stadio iniziale delle infezioni.
Nel Cuneese si è constatata una certa ricorrenza degli attacchi a carico dei medesimi frutteti e questo elemento è uno di quelli che inducono a pensare che l'infezione si origini in campo anziché in magazzino. I frutteti colpiti sono generalmente situati in posizioni pianeggianti, talora particolarmente umide per la vicinanza a corsi d'acqua. Premesso che l’arco temporale delle osservazioni risulta, al momento, ancora limitato, sembrerebbe anche delinearsi una tendenziale sovrapposizione tra l’areale di diffusione del marciume lenticellare asciutto e quello di maggior incidenza della patina bianca, inestetismo dei frutti indotto principalmente da miceti del genere Tilletiopsis. Non sono state invece indagate, finora, altre importanti correlazioni, quali quelle con la natura del terreno, il sesto di impianto, l’orientamento delle file, la potatura, le concimazioni, le irrigazioni, l'eventuale presenza di reti antigrandine ed i trattamenti antiparassitari. A quest'ultimo riguardo va purtroppo rilevato che gli interventi effettuati in campo con dodina in alcuni appezzamenti con presenza della malattia non sembrerebbero finora confermare i buoni risultati forniti precedentemente dal fungicida nel corso della citata sperimentazione in vitro, dalla quale era emersa come il principio attivo più efficace tra quelli testati. Ciò si potrebbe forse spiegare con l'insufficiente conoscenza della bioepidemiologia del patogeno, che non avrebbe consentito un'ottimale posizionamento degli interventi.
Va rilevato, comunque, che sussistono elementi per ritenere che la patogenicità del fungo possa essere piuttosto debole e che frutti e foglie vengano per lo più infettati (anche se i frutti, talora, in forma grave) solo in seguito a loro pregresse alterazioni di natura abiotica (anomala dilatazione delle lenticelle per eccessi idrici nel caso dei frutti, necrosi indotte da fisiopatie o microlepidotteri minatori nel caso delle foglie).
Osservazioni bioepidemiologiche
In considerazione del fatto che le infezioni tendono a ripresentarsi nei medesimi frutteti nel corso degli anni, che tamponi effettuati in passato dal CReSO sulle strutture dei magazzini avevano fornito esito negativo (Di Mauro, 2013, com. pers.), che i suddetti magazzini vengono peraltro disinfettati annualmente dopo lo svuotamento e che, come accennato, non si sono mai individuate manifestazioni del patogeno sui frutti pendenti, ma se ne sono riscontrate a livello fogliare, si è ipotizzato che il micete possa presentare un ciclo bioepidemiologico comportante, al pari dell'agente della ticchiolatura, lo svernamento nelle foglie cadute al suolo nel corso dell'autunno. Su di esse, all'inizio della successiva primavera, si differenzierebbe poi la forma perfetta sessuata (teleomorfo), verosimilmente riferibile al genere Mycosphaerella, come per tutte le altre specie del genere Ramularia delle quali sia nota l'esistenza della forma ascofora. Le ascospore emesse nel corso della primavera darebbero poi inizio, sulle foglie neoformate, alle infezioni primarie di Ramularia mali (forma imperfetta asessuata o anamorfo), alle quali verosimilmente si succederebbero un numero imprecisato di infezioni fogliari secondarie. In una fase fenologica ancora imprecisata, probabilmente non lontana dalla raccolta, avverrebbe poi la colonizzazione, inizialmente asintomatica, delle lenticelle dei frutti.
Poiché il presupposto di tutto ciò è rappresentato dalla presenza, verosimile ma mai dimostrata, della forma perfetta, nell'autunno 2014 il SFR ha avviato un’indagine per verificarne l'esistenza. In un meleto di Ambrosia, sito in comune di Cuneo e caratterizzato da ricorrenti infezioni dei frutti da R. mali, si è provveduto a raccogliere, a Ottobre inoltrato, diverse foglie con sintomi riferibili a infezioni del micete. Di queste, una decina con i sintomi più tipici sono state fotografate, numerate e poi inserite singolarmente in una bustina di garza. Successivamente tali bustine, insieme al resto delle foglie raccolte, sono state collocate in una cassetta di legno, del tipo di quelle usate per la frutta, chiusa superiormente con una rete metallica. La cassetta è poi stata collocata al suolo lungo un filare del frutteto, fissandola con filo metallico plastificato alla base di due piante contigue.
A fine aprile 2015 la cassetta è stata poi recuperata, se ne sono estratte le bustine e da queste le foglie. Si è constatato che il loro stato di conservazione consentiva ancora, nella quasi totalità dei casi, di riconoscerne la morfologia originaria. Mettendo a confronto ogni foglia recuperata con la fotografia scattatale al momento della raccolta dalla pianta, è stato possibile reindividuare le aree con i sintomi dell’infezione, sulle quali andare a ricercare gli ipotizzati pseudoteci di Mycosphaerella sp. E, in effetti, le osservazioni effettuate allo stereomicroscopio prima ed al microscopio ottico poi hanno consentito di evidenziare la presenza di pseudoteci nerastri, globosi (fig. 1), di diametro variabile da 50 a 100 µm circa (media intorno ai 70 µm), contenenti aschi cilindrici, bitunicati (fig. 2), di lunghezza variabile da 33,4 a 38 µm (media 35,8 µm) e di larghezza variabile da 6,5 a 7,4 µm (media 7 µm), all’interno dei quali si osservavano 8 ascospore ialine, fusoidi, bicellulari, con presenza di leggero restringimento in corrispondenza del setto (fig. 3), di lunghezza variabile da 8 a 11,7 µm (media 10,1 µm) e di larghezza variabile da 2,8 a 3,4 µm (media 3 µm), tutte caratteristiche distintive dei miceti ascrivibili al genere Mycosphaerella.
Al fine di confermare, al di là di ogni possibile dubbio, la relazione metagenetica tra R. mali e la Mycosphaerella individuata, si sono prelevate minuscole porzioni di tessuto fogliare contenenti pseudoteci, triturandole poi, con poca soluzione fisiologica sterile, in un mortaietto sterile fino ad ottenere una sospensione leggermente torbida, nella quale non fossero più individuabili singoli frammenti fogliari. Successivamente se ne sono effettuate diluizioni 1:2 ed 1:10 in soluzione fisiologica sterile, quindi 100 microlitri di ogni sospensione sono stati piastrati in ciascuna di due capsule Petri contenenti Water Agar (WA), per un totale di 4 piastre inseminate. Dopo 24 ore di incubazione a 23 °C, le capsule sono state osservate al microscopio rovesciato ed in tutte si sono riscontrate diverse ascospore germinanti di Mycosphaerella. Dieci di tali ascospore sono state quindi prelevate singolarmente e trasferite ciascuna in una capsula di WA, incubata poi a 23 °C con 12 ore di illuminazione e 12 ore di buio. In un arco di tempo compreso tra 4 e 7 giorni, in 9 capsule su 10 si sono sviluppate colture monosporiche, in purezza o associate, nei casi a crescita più stentata, a sviluppo di batteri, successivamente eliminati mediante trapianto su WA addizionato di ampicillina (500 µg/ml) e rifamicina (10 µg/ml). Tutte le colture evidenziavano, come atteso, fruttificazioni ifali tipicamente riferibili, per aspetto e dimensioni, a R. mali e, dopo trapianto su Potato Dextrose Agar (PDA), presentavano caratteristiche di forma, colore e velocità di crescita comprese tra quelle riportate in letteratura per il suddetto Deuteromicete su tale mezzo di coltura (fig. 4).
Va osservato che questa acquisizione non ha un interesse meramente accademico, ma potrebbe aprire interessanti prospettive per eventuali interventi estintivi autunnali con la somministrazione di concimi ad elevato contenuto di azoto (urea, ecc.) sulle foglie cadute al suolo. Interventi di questo tipo, tuttavia, avendo una valenza non esclusivamente fitosanitaria ma, più generalmente, agronomica, andranno attentamente valutati nei singoli casi, in un'ottica complessiva di corretta gestione del frutteto.
Restano ancora da chiarire, comunque, alcuni importanti aspetti della bioepidemiologia del micete. Si potrebbe, con l'ausilio di captaspore, monitorare la tempistica e l'entità delle emissioni di ascospore nonché la correlazione delle emissioni stesse con i principali parametri climatici. Andrebbe poi verificato se sussistano uno solo o più cicli di infezioni fogliari secondarie. Infine - e questo è l'aspetto più importante dal punto di vista fitoiatrico - occorrerebbe individuare con precisione la fase fenologica nella quale si verifica la contaminazione delle lenticelle dei frutti, per posizionare in modo ottimale i necessari interventi anticrittogamici.
Fig 1. Pseudoteci
Fig 2. Aschi
Fig 3. Ascospore
Fig 4. Coltura di R. mali
Bibliografia
- Crous P.W., Summerell B. A., Carnegie A. J., Mohammed C., Himaman W, Groenewald J. Z., 2007. “Foliicolous Mycosphaerella spp. and their anamorphs on Corymbia and Eucalyptus”. Fungal Diversity, 26, pp. 174-175
- Gianetti G., Grosso S., Ortalda E., Di Mauro G., 2012. “Segnalata in Piemonte Ramularia eucalypti su mele frigoconservate”. L’Informatore Agrario, 9, pp. 72-73
- Giordani L., Grosso S., Vittone G., Nari L., 2012. “Rinvenuta in Piemonte su pere frigoconservate Ramularia eucalypti”. L’Informatore Agrario, 25, pp. 66-67
- Lindner L., 2013. “Laimburg, Centro di Sperimentazione Agraria e Forestale. Diagnostica 2013”. URL: www.laimburg.it
- Ortalda E., Gianetti G., Grosso S., Giordani L., 2014. “Melo, prove di efficacia contro il marciume lenticellare asciutto”. Terra e Vita, 16, (suppl. Informatore Fitopatologico), pp. XI-XIII
- Videira S.I.R, Groenewald J.Z., Kolecka A., van Haren L., Boekhout T., Crous P.W., 2015. “Elucidating the Ramularia eucalypti species complex”. Persoonia, 34, pp. 50-64